于洪巍：代谢过程中关键酶的定向进化及高通量筛选方法的建立

中国生物发酵产业协会于2017年4月20日至4月23日在广西省柳州市成功举办第五届新型有机氮源生物发酵领域应用与发展趋势研讨会。

本届有机氮源的主题是 “氮源科学调控高效精准生产”，主要探讨生物发酵产业如何从发酵工艺的氮源优化与调控入手，将后提取，环保、安全认证等诸多生产经营环节作为一个整体进行通盘考虑、寻求最佳解决方案，实现企业经营效益的最大化。

来自浙江大学的于洪巍教授作了主题为代谢过程中关键酶的定向进化及高通量筛选方法的建立的报告。于老师研究领域包括：酶固定化，酶定向进化及理性设计, 酶催化手性药物拆分及合成的研究；代谢工程。代谢工程与合成生物学技术手段的快速发展给异源化学品的生产带来了曙光。

定向进化就是通过随机突变使酶基因产生大量突变体，结合高通量筛选方法，定向筛选特定酶学性质得到提高的突变体酶改造方法包括理性设计、半理性设计和定向进化虽然目前已经存在几种主流的途径组装方法，但各有优缺点，特别是存在例如遗传不稳定、营养缺陷型标记依赖、标记去除过程繁琐等问题。

为了尽可能避免这些问题，于老师建立了一套即插即用，并且标记可以快速去除以及重复利用的途径组装工具盒建立基于菌落颜色的高通量筛选方法，对番茄红素合成途径关键酶CrtYB进行了定向进化，提高了双功能酶CrtYB的底物专一性。

通过关键酶的分子改造，避免了副产物β-胡萝卜素的形成，大幅提高了目标产物番茄红素的纯度；结合合成途径基因的拷贝数调节，最终番茄红素产量达到了1.6 g/L （24.4 mg/g DCW），该产量是目前利用基因工程改造真核微生物报道的最高产量。

此次报告上，于老师对于酵母和大肠杆菌中包括4个方面代谢实例：酿酒酵母番茄红素合成途径关键酶CrtYB的定向进化、酿酒酵母虾青素合成途径关键酶BKT的定向进化、酿酒酵母异戊二烯合成途径关键酶ISPS的定向进化和大肠杆菌MEP途径多个关键酶的共定向进化。